ИТЭБ 
 
  Новости
  Пресс-релизы
  История
  Структура
  Научные направления
  Основные достижения
  Диссертационный совет
  Ученый совет
  Совет молодых ученых
  Научно-образовательный центр
  Наукоемное производство
  Научные школы
  Нормативные документы
  Библиотеки
  Телефоны

Как биологи делают из ДНК комету. Наука все дальше проникает в живую клетку

Наш организм постоянно подвергается различным вредным воздействиям, будь то излучение от мобильных устройств, табачный дым, таблетки или красители. Как наши гены реагируют на эти воздействия? Оказывается, существует несколько методов это узнать. Один из них — метод ДНК-комет — развивают в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН в Пущино в лаборатории радиационной молекулярной биологии.

Эксперимент

Приезжаю утром в лабораторию в ИТЭБ РАН. Там все готово для эксперимента. Слайды с препаратом помещены в щелочной раствор, таймер отсчитывает минуты. Сегодня ученые будут наблюдать поврежденные клетки асцитной карциномы Эрлиха. Это рак, который развивается в жидкости, заполняющей брюшную полость мышей. Накануне эксперимента клетки откачали шприцем прямо из животных, зафиксировали в агарозном геле, затем образцы облучили в рентгеновском аппарате дозой 8 Грей, смоделировав сильное внешнее воздействие. Рентгеновские лучи порождают множество активных форм кислорода, которые буквально режут ДНК. Потом образцы погрузили в лизирующий раствор, чтобы разрушить мембраны клетки, ядра и освободить ДНК.

Пищит таймер, техник Татьяна Михайловская промывает слайды и помещает в электрофоретическую камеру. Под действием электрического тока разорванные петли ДНК вытягиваются, поэтому при увеличении клетки выглядят как кометы. Круглая голова — это неповрежденная часть ДНК, а хвост — то, что от нее оторвалось. Чтобы увидеть всю эту красоту, клетки красят флуоресцентным красителем.

— Сейчас мы отрабатываем методику, чтобы применить ее на инвертированном флуоресцентном микроскопе в Центре коллективного пользования, — рассказывает старший научный сотрудник, руководитель работ Николай Сирота. Он первым в России стал использовать метод ДНК-комет, внес в него много нового, заложил основы для внедрения метода в широкую практику.

Пока идет электрофорез, заведующая лабораторией, кандидат биологических наук Елена Кузнецова объясняет, что именно показывают ДНК-кометы:

— Некоторое количество разрывов ДНК в клетках происходит постоянно. Но у клеток очень мощная система восстановления ДНК, которая с возрастом не утрачивает эффективности. Базовый уровень повреждений в клетке составляет около 4%.

Она показывает на график, где изображен уровень поврежденных ДНК в лейкоцитах крови 21 здорового человека. Ровность графика нарушает пик — так выглядит резкий рост повреждений у одного из доноров. Это свидетельствует о том, что человек подвергается какому-то вредному воздействию или болеет.

— В литературе есть данные о том, что при ожирении уровень повреждения ДНК повышен, потому что ткани сдавливаются, нарушается кислородный баланс, при ишемии, гипертонии, некоторых видах онкологии, у курильщиков, работников вредных производств, — говорит Елена Ананьевна.

Снова звучит таймер. Все, эксперимент завершен. Николай Петрович садится за микроскоп, кладет слайд, выравнивает его по координатам и сравнивает с фотографией того же слайда, сделанной вчера, до того как образец покрасили и подвергли электрофорезу. Не сразу, но удается совместить поля зрения двух изображений. Фотография клеток на слайде до процедур должна совпадать с фотографией клеток после процедур. Это нужно, чтобы исключить технические ошибки в процессе эксперимента.

Заглядываю в микроскоп и я. На черном фоне ярко алеют четыре «кометы» — это поврежденные ДНК. А вот на фотографии слайда до окрашивания видны три клеточных ядра. Куда же пропала одна клетка?

— Есть такой парадокс в радиотерапии. Какой бы дозой ни облучали, всегда найдутся раковые клетки, которые выживут. Они потом делятся, и опухоль может снова вырасти, — говорит Николай Петрович.

Клетка, которую я не вижу, не поддалась облучению. Ее мембрана осталась цела, и потому краситель в нее не проник. Мембрана разрушилась только при лизировании, и ДНК клетки высветил флуоресцентный краситель.

Когда методика будет отработана, ученые приступят к решению главной задачи — изучить, как доксорубицин, один из самых сильных препаратов для химиотерапии, воздействует на ДНК через несколько суток после введения. Доксорубицин вводят больному в неактивной форме. В первые часы он проникает в клетку, трансформируется там и способствует выработке большого количества активных форм кислорода, которые убивают все вокруг. Гибнут и раковые, и здоровые клетки. А что происходит потом, никто толком не знает. Есть данные, что доксорубицин накапливается в клетках и участвует в сшивании цепей ДНК. Последние работы показали, что препарат накапливается в ДНК митохондрий — особых органеллах клетки, которые вырабатывают энергию. После повреждений, причиненных химиотерапией, клетки начинают восстанавливаться и требуют большого количества энергии. Если митохондрии работают нормально, то и восстановление идет. Но как влияет доксорубицин на митохондрии? Он их угнетает или, наоборот, стимулирует? Это и намерены выяснить ученые. Их конечная цель — понять, как разные пациенты реагируют на доксорубицин, нащупать индивидуальные различия, чтобы помочь врачам более тонко настраивать схему химиотерапии.

— Когда отработаем метод на клетках животных, перейдем к исследованиям с клетками пациентов, — делится планами ученый.

— Одновременно мы будем следить за результатами эксперимента методами молекулярной биологии, с помощью ПЦР в реальном времени. Тогда у нас будет комплексная картина, понимание, что происходит в одной клетке при повреждении. Это долгосрочная задача, которую мы, может, и не решим при жизни. Продолжит следующее поколение.

Кто изобрел ДНК-кометы

В 1984 году шведские ученые поместили клетки в специальный гель, который застывал при 20 градусах. Таким образом, клетки сохранялись живыми, и далее можно было определять, насколько повреждена в них ДНК — носитель генетической информации. Метод назвали «Comet assay», буквально «кометный анализ», из-за формы клеток с поврежденной ДНК, которую наблюдают во флуоресцентном микроскопе.

После чернобыльской аварии Николай Сирота с коллегами участвовал в исследованиях образцов крови людей, проживавших в зоне поражения. Ученых интересовало, насколько повреждена ДНК у людей.

Методы в то время были очень дорогостоящие и долгие в обработке. Усовершенствованный метод ДНК-комет, который позволял определять повреждения ДНК, вызванные радиационным излучением, появился позже, в конце 80-х. Для анализа достаточно просто взять кровь из пальца. Благодаря этому метод стал популярен и быстро распространился в научном мире. Начали осваивать его и в Пущино.

Сначала ДНК-кометы снимали под микроскопом на обычный фотоаппарат, длину хвоста измеряли линейкой, затем данные обрабатывали вручную. Несмотря на трудности, в 1991 году Николай Сирота с соавторами опубликовал первую в России статью с результатами исследований, выполненных этим методом.

Затем последовал период стагнации науки, и вернуться к методу ДНК-комет удалось только в 2000-м. Вместе с коллегами из Института биофизики клетки Николай Сирота участвовал в исследованиях, поддержанных грантом НАТО, который позволил разработать программное обеспечение для обработки изображений и существенно развить метод. Ученые изобрели особые подложки для работы сразу с несколькими слайдами, что увеличивало производительность метода.

— Чем интересен этот метод? Он позволяет узнать, как действуют искусственные вещества на ДНК человека, не будут ли они вызывать заболевания, — поясняет Николай Петрович.

Сейчас каждое новое вещество, будь то краситель, лекарство, материал и т.д., обязательно тестируют на генотоксичность, то есть степень повреждающего воздействия на ДНК. Самый распространенный микроядерный тест уступает методу ДНК-комет по скорости и экономичности. Но метод ДНК-комет еще не стандартизован, поэтому сложно сравнивать результаты исследований, полученные в разных лабораториях. К тому же, не проанализированы накопленные за годы исследований этим методом данные.

Каждые два года ученые из всего мира, которые развивают метод ДНК-комет, собираются на конференцию. Регулярно в них участвует и Николай Сирота. В этом году конференция проходила в Испании. По ее итогам международный оргкомитет принял решение провести следующую конференцию в 2019 году в России, в ИТЭБ РАН. Работа по подготовке конференции уже началась. Оргкомитету предстоит составить программу, найти гранты на поддержку российских ученых и молодежи, ведь для многих такие поездки и оргвзносы не по карману. На конференцию ожидают около двух сотен участников из-за рубежа и со всей страны. Ведь метод ДНК-комет активно используют в России — в Москве, Ростове-на-Дону, Саратове, Воронеже, Сыктывкаре, на Дальнем Востоке.

От рака к кофе

Метод ДНК-комет востребован в научных кругах для тестирования новых и уже существующих лекарственных препаратов. Несколько лет назад Николай Сирота участвовал в исследованиях врачей из Ростовского Института онкологии, которых интересовало, как доксорубицин действует на организм через несколько дней после его введения. Ученые тестировали образцы крови 17 пациенток в ходе трех курсов химиотерапии, через 21 день каждый, и обнаружили, что только у четырех из них заметен повреждающий эффект ДНК, у остальных его уже нет — клетки восстановились, хотя препарат по прежнему обнаруживался в крови.

— Это неожиданный результат. Мы просим врачей проследить за состоянием этих четырех женщин и дальше; выяснить, какие последствия химиотерапии у них обнаружатся, — говорит ученый.

Поскольку метод новый, то статистики по людям, чью кровь изучали, не накоплено. Работу в этом направлении только начало международное научное сообщество. Ученые решили собрать воедино данные по пациентам, которые участвовали в обследовании этим методом. В проекте задействованы ИТЭБ и несколько российских лабораторий. Данные о том, какое лечение получал человек, что и как прошло, как менялось его состояние, какие наблюдались осложнения, помогут понять, каковы же отдаленные последствия тех или иных воздействий, вызывающих повреждение ДНК.

Отдельно стоит вопрос о том, что происходит с ДНК при хронических повреждающих воздействиях. Взять, к примеру, кофе. Многие пьют по нескольку чашек в течение дня, что можно рассматривать как хроническое воздействие. Ученые из Швеции сейчас как раз выясняют этот вопрос. В их эксперименте участвуют 160 добровольцев, которые бесплатно пьют кофе, соки и еще получают за это гонорар. Так что скоро мы узнаем, полезен кофе или вреден.

 

Релиз подготовлен Татьяной Пичугиной, фото автора.

Статья опубликована в "МК В СЕРПУХОВЕ" 22 — 29 ноября 2017 года